Viermal schneller als herkömmliche PCR-Methoden ist ein neuer Ansatz namens RADICA hochspezifisch, sensitiv und resistent gegen Inhibitoren
Forscher von Critical Analytics for Manufacturing Personalized-Medicine (CAMP), eine interdisziplinäre Forschungsgruppe (IRG) der Singapore-MIT Alliance for Research and Technology (SMART), der Forschungsfirma des MIT in Singapur, hat eine neue Methode zum schnellen und genauen Nachweis von viralen Nukleinsäuren – ein Durchbruch, der leicht angepasst werden kann, um verschiedene DNA/RNA-Ziele in Viren wie dem Coronavirus zu erkennen.
Obwohl die RT-qPCR als Goldstandard für den Virusnachweis gilt, gibt es Einschränkungen und kann oft zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Eine genaue Version ist, dass die digitale PCR-Methode eine relativ lange Reaktionszeit erfordert, teure Ausrüstung, eine genaue Temperaturkontrolle und Zyklen erfordert.
Die neue methodische Entwicklung von CAMP – der RApid DIgital Crispr Approach (RADICA) – ermöglicht die absolute Quantifizierung viraler Nukleinsäuren in 40-60 Minuten isotherm im Wasserbad, einem prototypischen und kostengünstigen Laborgerät. Die Forschung des Teams wird in einem Papier mit dem Titel „Digitale CRISPR-basierte Methode zum schnellen Nachweis und zur absoluten Quantifizierung von Nukleinsäuren” kürzlich in der renommierten Zeitschrift veröffentlicht Biomaterialien.
Die RADICA-Methode wurde an synthetischer SARS-CoV-2-DNA/RNA und am Epstein-Barr-Virus in kultivierten B-Zellen und Patientenserum getestet. Die Forscher sagen, dass die Methode angepasst werden könnte, um andere Arten von Viren und in anderen Arten von Proben wie Speichel und Zellkulturmedien zu erkennen. RADICA kann das Virus auch von seinen nächsten Verwandten unterscheiden.
„Dies ist die erste berichtete Methode zum Nachweis von Nukleinsäuren, die die Sensitivität der isothermen Amplifikation und die Spezifität der CRISPR-basierten Detektion in einem digitalen Format nutzt – was eine schnelle und spezifische Amplifikation von DNA ohne zeitaufwändige und teure thermische Zyklen ermöglicht.“ “, sagt Dr. Xiaolin Wu, Postdoktorandin am SMART CAMP. „RADICA bietet eine viermal schnellere absolute Quantifizierung im Vergleich zu herkömmlichen digitalen PCR-Methoden.“
Die Forscher verwenden Tausende von 15-µl-DNA/RNA-Proben und werden durch das Cas12a-Protein amplifiziert und identifiziert, ein Enzym, das das Zielsignal in ein Fluoreszenzsignal umwandeln kann. Als Ergebnis kann eine absolute Quantifizierung erreicht werden, indem die Anzahl der Proben gezählt wird, die die Ziel-DNA/RNA aufweisen und beleuchtet werden.
Derzeitige Sterilitätstests dauern etwa 14 Tage, was für klinische Anforderungen zu langsam ist, aber RADICA verkürzt den Prozess auf Stunden. RADICA identifiziert auch, wie viele Viren in der Probe enthalten sind, was Ärzten und Forschern helfen kann, den Behandlungsverlauf zu bestimmen sowie Zelltherapieprodukte herzustellen und zu bevorraten. Die Methode kann auch zum Nachweis von DNA/RNA-Zielen verschiedener Viren verwendet werden und kann an Geräte angepasst werden, die üblicherweise in Krankenhäusern und Servicelabors verwendet werden, und bietet so einen möglichen neuen Weg zur Bekämpfung von Pandemien.
Die Forschung wird von SMART durchgeführt und von der National Research Foundation (NRF) Singapur im Rahmen ihres Programms Campus for Research Excellence And Technological Enterprise (CREATE) unterstützt.
Bildbeschreibung: „Abbildung zeigt die schematische Darstellung von RADICA. Nach der DNA/RNA-Extraktion können Proben zum Nachweis und zur Quantifizierung verschiedener Targets verwendet werden. Die RPA-Cas12a-Antwort in jeder positiven Partition amplifiziert die Ziel-DNA exponentiell, was eine stärkere Cas12a-Aktivierung auslöst und die Fluoreszenzauslesung erhöht. Auf diese Weise wird die Reaktionszeit von RADICA 4-mal verkürzt (von 4 Stunden auf 1 Stunde im Vergleich zu dPCR).“
